Методика постановки реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с определением цистеинустойчивых антител

Страница 1

Наибольшее диагностическое значение при серологическом исследовании на бактерионосительство имеют иммуноглобулины М (IgM-антитела константой седиментации 19S). Нормальные и прививочные антитела к липополисахаридам сальмонелл принадлежат в основном к классу IgM. Эти же антитела появляются уже с 3-го дня от начала болезни и лишь к концу первой недели, а в ряде случаев - и позже, нарастают IgG-антитела. Особенно значительно увеличивается удельное

содержание в сыворотке IgG-антител при формировании острого и хронического бактерионосительства. В сыворотках хронических бактерионосителей в большинстве случаев IgM-антитела отсутствуют или имеются в небольшом титре, а основная масса антител представлена IgG. У транзиторных бактерионосителей определяются практически только IgМ-антитела.

Установлено, что при обработке сыворотки некоторыми редуцирующими веществами, в частности цистеином, IgG-антитела относительно устойчивы, тогда как IgМ- и IgА-антитела инактивируются, что позволяет определить удельное содержание IgG-антител в сыворотке.

Рекомендуется использовать L-цистеин сернокислый или цистеин (чистый) отечественный, либо "Reanal" (Венгрия). Раствор цистеина готовят ex tempore (15 мг на 1 мл растворителя). Солянокислый цистеин растворяют в 0,1N растворе NaOH

с таким расчетом, чтобы рН готового раствора был равен 7,0-7,2.

Цистеин сначала растворяют в небольшом количестве 0,1N раствора NаОН и при значении рН 7,0-7,2 доводят до нужного объема 0,85-процентным раствором хлорида натрия. Контроль за рН раствора обязателен. Раствор цистеина может храниться не более 30-60 мин. Ввиду возможных отклонений активности цистеина необходимо уточнять для каждой серии препарата рабочую концентрацию раствора цистеина на сыворотках, заведомо содержащих IgМ- и IgG-антитела.

Для исследования необходимо получить 0,2-0,4 мл цельной сыворотки, которую делят на две части. Одну часть разводят 1:5 забуференным 0,85-процентным раствором хлорида натрия, смешивают с равным объемом раствора цистеина, помещают в пробирку и заливают слоем стерильного вазелинового масла (или помещают во флакончик с резиновой пробкой так, чтобы между содержимым и пробкой оставалось минимальное пространство во избежание окисления цистеина кислородом воздуха). Вторую часть сыворотки (без цистеина) разводят

забуференным 0,85-процентным раствором хлорида натрия 1:10, заливают слоем вазелинового масла и помещают во флакончик с резиновой пробкой. Пробирки (флаконы) с сыворотками, обработанные и не обработанные цистеином, выдерживают в термостате при 37°С в течение 18 ч. Далее обе части сыворотки титруют в нескольких парных рядах соответственно числу эритроцитарных диагностикумов, начиная с разведения 1:20, в пробирках, полистироловых панелях, "планшетах для иммунологических реакций однократного применения" или планшетах микротитратора Такачи в объеме 0,05 или 0,1 мл. Для разведения

используют забуференный 0,85-процентный раствор хлорида натрия (фосфатный буфер, рН 7,0-7,2). Однако предпочтительней готовить 0,85-процентный раствор хлорида натрия с нормальной прогретой при 56°С в течение 30 мин сывороткой (кроличьей, лошадиной, крупного рогатого скота). Нормальную сыворотку добавляют из расчета 1 мл на 100 мл изотонического раствора при условии, что в этом разведении будут отсутствовать антитела к применяемым диагностикумам, что

проверяется предварительно для каждой новой серии сыворотки.

В качестве эритроцитарных сальмонеллезных диагностикумов используют: эритроцитарный Vi-диагностикум, диагностикумы эритроцитарные сальмонеллезные О-антигенные А-1, -2, -12; В-1, -4, -12; Д-1, -9, -12. Все серии эритроцитарных диагностикумов предварительно контролируют с прилагаемой к диагностикуму контрольной сывороткой. Целесообразно одновременно исследовать сыворотку для выделения всех групп антител (О, Н, Vi) к брюшнотифозным и паратифозным бактериям. Диагностикумы в рабочем разведении вносят в каждую лунку разведения сыворотки в равном объеме (0,05 или 0,1). Каждый диагностикум вносят в два ряда разведений сыворотки (обработанной и необработанной цистеином). В одну из лунок, содержащую растворитель без испытуемой сыворотки (0,05-0,1 мл), вносят равный объем диагностикума для контроля спонтанной агглютинации.

Планшеты помещают в термостат при 37°С на 2 ч, после чего учитывают результаты по обычной для РПГА методике. При учете результатов РПГА с цистеином нужно учитывать, что для выявления бактерионосителей имеет значение не столько абсолютный титр антител, сколько удельное содержание в сыворотке IgG-антител.

Если обработка цистеином не снижает титр или снижает его только на

одно или два разведения, то это говорит о значительном содержании в

Страницы: 1 2

Дополнительные материалы

Наиболее опасные места в цехе:
Щитовые помещения и реакторные блоки отделений гидроформилирования и гидрирования, где возможен прорыв газов и легковоспламеняющихся и токсичных продуктов. Помещения насосных высокого давления и компрессорной циркуляционного газа, где возможен прорыв газов и легковоспламеняющихся и токсичных продуктов в производственные помещения. Парк сжиженных газов, содержащий большие объемы продуктов (пропилена, продуктов гидроформилирования) под избыточным давлением до 12-20 кгс/см2, что создает опаснос ...