Характеристика компонентов, используемых в ИФА.

Страница 1

Ферменты.

Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:

– высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;

– наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;

– возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;

– отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза (табл.1). Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

Субстраты.

Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

Основные требования к субстрату:

– обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате;

– образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;

– субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.

Таблица 1.

Ферменты и их субстраты наиболее широко используемые в ИФА.

Фрмент

Источник получения

М.М. (кДа)

Субстрат (рекомендуемая длина волны при фотометрии, нм)

Конъюгирующий реагент

Пероксидаза хрена

Хрен (Armoracia rusticana)

40

О-фенилендиаминдигидро-хлорид (ОФД, 492 нм)

5-аминосалициловая кислота (450 нм), диаминобензидин, о-дианизидин.

Глутаральдегид

Мета-периодат натрия

N-сукцинимидил-3 (2-пиридилдитио) пропионат

β-D-галак-тозидаза

E. Coli

540

О-нитрофенил-β-D-галактозид (420 нм)

Мета-малеимидобензол-N-гидроксисукцинимидный эфир

Щелочная фосфотаза

E. Coli, слизистая кишечника теленка

84-150

Р-нитрофенилфосфат (405 нм), 5-Бром-4-хлоро-3-индолил фосфат

Глутаральдегид

Страницы: 1 2 3

Дополнительные материалы

Витамин В2 (рибофлавин)
Рибофлавин - водорастворимый витамин, требующий ежедневного восполнения. Этот витамин образует важную часть витаминного В-комплекса, так как он приводит в движение углеводород из жиров. Витамин В2 неустанно доставляет энергию к клеткам. При регулярном занятии спортом или тяжелой работе используется большое количество рибофлавина. Функции: способствует росту и репродуктивным функциям, сохраняет здоровой кожу, волосы, ногти, помогает залечить язвочки рта, губ и языка, улучшает зрение, уменьша ...