MedicSection

Характеристика компонентов, используемых в ИФА.

Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образу­ют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемипюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка.

Антигены и антитела.

АГ и AT, используемые в ИФА, должны быть высокоочишенными и высокоактивными. Кроме того, АГ должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант, чужеродностью и гомогенностью. Многие синтетические и рекомбинантные АГ вирусов и бактерий хорошо себя зарекомендовали при использовании в ИФА. Это существенно повысило специфичность и воспроизводимость метода за счет сведения к минимуму перекрестных реакций.

Одним из наиболее важных реагентов в ИФА являются антитела. Чувст­вительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности ис­пользуемых антител. Используемые антитела могут быть поли- или монокли­нальными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgGl, IgG2), антиаллотипическими или антиидиотипическими. При низкой аффинности AT распад комплекса АГ-АТ приводит к удалению связанного АГ из системы. Чув­ствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации АГ (AT) в испытуемых образцах.

Образование конъюгата

Конъюгат – это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Обра­зование коньюгата – один из важных этапов проведения ИФА.

При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введе­ния ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою био­логическую активность: фермент - способность взаимодействовать с субстра­том, а антиген или антитело - антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позво­ляет использовать конкурентные методы. В этом случае на конечном этапе можно измерять активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет избежать процедуры отмывки и делает анализ более удобным. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойст­вам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антиге­на с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками про­изводится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляет­ся иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

Наиболее широкое распространение получили ковалентные способы при­готовления конъюгатов. Выбор реакции связывания определяется типом дос­тупных функциональных групп в данных белковых молекулах. В качестве реа­гентов, используемых для введения фермента в молекулы антигенов и антител, используют глутаровый альдегид, периодат натрия и др.

Существует одноэтапный и двухэтапный методы получения конъюгатов с помощью глутарового альдегида. Могут образовываться конъюгаты различных размеров с редуцированной ферментативной активностью (15 - 60 % от свобод­ного фермента). Образовавшийся конъюгат больших размеров может стерически затруднять определение тестируемого вещества. Конъюгаты с относительно низкой молекулярной массой состоят из Fab-фрагмента и одной молекулы фер­мента.

Дополнительные материалы

Характеристика сырья и материалов
Наименование Обозначение НД Сорт или артикул Показатели, обязательные для проверки Примечание А - сырье Вода ФС 42-2619-97 Очищенная рН 5,0 – 6,8, сух. остаток 0,001%, NH4+ не более 0,00002% Растворитель Глицерин ГФ X стр. 876 Медицинский Показатель преломления, остаток после прокаливания, содержание хлоридов, тяжелых металлов, мышьяка. Вспомогательное вещество Желатин ГФ X ст. 309 Медицинский Растворимость, запах, рН, относ ...