MedicSection

Характеристика компонентов, используемых в ИФА.

В результате двухэтапного синтеза, который заключается в поэтапном получении сначала модифицированного с помощью сшивающего агента фер­мента, его выделении, а затем последующем взаимодействии его с антигеном (антителом), образуются молекулы однородного состава, содержащие 1-2 мо­лекулы фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую фер­ментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких обра­зовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5 - 10 %).

Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает 70-90 % от начального количества фермента).

Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами:

- высоким антительным тигром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, умень­шить неспецифическое связывание;

- достаточной специфичностью в рабочем разведении;

- преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные фор­мы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции;

- оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1);

- достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство опреде­ляется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате.

Твердая фаза

В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различ­ные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие вещест­ва. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планше­ты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.

Иммобилизация антигена или антител на твердой фазе возможна тремя путями:

– пассивная адсорбция, основанная на сильных гидрофобных взаимодействиях между белками и синтетической поверхностью;

– ковалентное прикрепление к твердой фазе;

– иммунохимическое и др. (нековалентное и неадсорбционное присоединение).

Пассивная адсорбция белков широко используется при проведении ИФА на платах для титрования, на нитроцеллюлозных мембранах. Пассивная адсорб­ция идет по принципу насыщения и коррелирует с молекулярной массой адсор­бируемого вещества. Адсорбционная поверхность мембран различного типа (нитроцеллюлоза, нейлон и др.) в 100-1000 раз выше, чем у пластика.

Полисахариды и сильногликозилированные белки часто имеют низкую аффинность для полистирола. Необходимы другие методы для их иммобилиза­ции, например, ковалентное присоединение с помощью глутарового альдегида. Ковалентное присоединение эффективно, если в качестве твердой фазы исполь­зуются гидрофильные бусы (агароза) и полистироловые бусы.

Иммунохимические методы основываются на использовании предвари­тельно адсорбированных «ловушечных» антител для иммобилизации антигена или антител. Антиген, иммобилизованный иммунохимически, в 10 раз активнее, чем пассивно адсорбированный антиген. Могут использоваться лектины или иммуноглобулин-связывающие белки бактерий, которые легко адсорбируются на пластике или других гидрофобных поверхностях , например конканавалин А (Кон А) или стаффилококковый белок А. Кон А способен иммобилизовать gp 120 - белок вируса ВИЧ.

Свободные сайты на поверхности твердой фазы, не связавшиеся с сорби­руемым агентом, могут фиксировать в ходе теста другие молекулы, в том числе и конъюгаты, что приводит к повышению фонового сигнала. Для предотвраще­ния неспецифического связывания после иммобилизации на твердую фазу ос­новного материала проводят обработку нейтральными для теста веществами. Наиболее популярные блокирующие агенты - бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин и др. Выбор блокирующего агента и условия проведения этого этапа зависят от типа твердой фазы, чувствительности системы.

Дополнительные материалы

Системы усиления сигнала.
При использовании высокоаффинных антител чувствительность отдельных вариантов ИФА очень высока и теоретически позволяет выявить единичные молекулы антигена, но на практике чувствительность ограничивается рядом факторов: активностью фермента, интенсивностью сигнала и методами учета сигнала. Системы усиления сигнала дают возможность повышать чувствитель­ность различных вариантов ИФА. Рассмотрим некоторые такие системы: На основе взаимодействия авидин-биотин. Молекулы кофермента биотина (м.м. 2 ...