Варианты постановки ИФА.

Страница 2

Основные этапы непрямого ИФА для определения антител:

1. Антиген адсорбируют на твердой фазе, затем отмывают от несвязавшихся компонентов.

2. Блокируют свободные месга связывания. Отмывают.

3. В лунки вносят исследуемый материал, инкубируют и затем проводят проце­дуру отмывки. Параллельно ставят пробы с положительным и отрицательным контролями.

4. Добавляют антиглобулиновый конъюгат в рабочем разведении, инкубируют, отмывают от несвязавшихся компонентов.

5. Вносят субстрат, инкубируют. По достижении оптимального уровня окраши­вания в лунках с положительным контролем реакцию останавливают, добавляя стоп-раствор.

6. Измеряют количество продукта реакции на ИФА-ридере (рис.3).

При оптимальных условиях проведения анализа метод высокоспецифичен и чувствителен. Он позволяет выявлять нанограммовые количества антител в сы­воротках исследуемых больных. Для получения удовлетворительных результа­тов необходима стандартизация реагентов и методических приемов. Этот вари­ант ИФА может также использоваться для тестирования моноклональных антител.

«Сэндвич» – вариант ИФА для выявления антигенов.

Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повто­ряющимися, пространственно разделенными эпитопами одинаковой специфич­ности.

При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с иссле­дуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные фер­ментом антитела (конъюгат) к тому же антигену и далее проводят все осталь­ные этапы реакции. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело.

Основные этапы анализа:

1. На твердой фазе иммобилизуют моноклональные антитела или аффинно-очищенные поликлональные антитела.

2. В лунки панелей вносят исследуемый образец, параллельно ставят положи­тельный контрольный образец и отрицательный контрольный образец в различ­ных разведениях. Инкубируют и отмывают.

3. В лунки вносят меченные ферментом моноклональные или поликлональные антитела – конъюгат. После инкубации проводят отмывку.

4. Вносят субстрат, инкубируют. Реакцию останавливают при достижении опти­мального окрашивания в лунках с положительным контролем.

5. Учет результатов на ИФА-ридере.

Основным достоинством метода является высокая чувствительность, пре­восходящая возможности других схем ИФА (рис.4).

Рисунок 3. Непрямой ИФА для выявления антител.

Конкурентный ИФА.

Этот вариант анализа основан на конкуренции меченых (конъюгат) и неме­ченых (исследуемых) антител за связывание с антигеном, адсорбированным на твердой фазе. Количество фермента, присоединившегося к твердой фазе, уменьшится пропорционально содержанию в смеси свободных антител. Для оп­ределения антигена используется тот же вариант, но в этом случае искомый ан­тиген конкурирует с меченым, стандартным антигеном за связывание с антите­лами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы.

Конкурентный метод требует минимального числа операций, незначительно­го расхода реагентов и легко может бытъ автоматизирован. При проведении конкурентного ИФА для выявления антител лучше использовать меченые мо­ноклинальные антитела, тогда конкуренция конъюгата с исследуемым образцом происходит за единственный эпитоп адсорбированного на твердой фазе антиге­на. Этот вариант ИФА применяется для определения различных соединений, таких как иммуноглобулины человека, раково-эмбриональный антиген, инсулин и др. Он позволяет выявлять антитела к диагностически значимым эпитопам инфекционных агентов.

Основные этапы анализа для выявления антигена (рис.5):

1. На твердой фазе иммобилизуют специфические для выявляемого антигена моноклональные антитела.

2. В лунки панелей вносят в известной концентрации антиген, меченный фер­ментом, и исследуемый образец. Проводят инкубацию и отмывку. Параллельно в соседних лунках ставят положительный и отрицательный контроли. Для по­строения калибровки используют стандартный немеченый антиген в различных разведениях.

3. Добавляют субстрат, инкубируют, останавливают реакцию при развитии оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем.

4. Учет реакции на ИФА-ридере.

В этом случае количество антигена в исследуемом образце обратно пропор­ционально ферментативной активности на твердой фазе.

Ингибиторный ИФА.

В этом варианте ИФА антиген, присутствующий в исследуемом образце, свя­зывается с моноклональными антителами, меченными ферментной меткой, и ингибирует их взаимодействие со стандартным антигеном, иммобилизованным на твердой фазе. Присутствие в образце даже следовых количеств специфичного к конъюгату антигена будет ингибировать связывание меченых антител с иммобилизованным антигеном. Степень ингибирования прямо пропорциональ­на содержанию антигена в растворе. Для проведения количественного анализа строят кали6ровочную кривую с помощью последовательных разведений стан­дартного антигена. Основные этапы ингибиторного ИФА для выявления антигена (рис.6).

Страницы: 1 2 3

Дополнительные материалы

Терапия. Артериальная гипертензия
Общие сведения Фамилия, имя, отчество Несмеянов Николай Иванович Возраст 54 года Образование среднее Профессия, должность, место работы водитель, автомобильная база Место жительства г. Москва Время поступления в клинику 12 февраля 2009 года История болезни № 6108/09 Дата курации с 2.03.09 по 17.03.09 Жалобы Жалобы при поступлении – больной жаловался на общую слабость, головную боль, головокружение, одышку, сердцебиение Жалобы на момент курации – больной жалоб не предъявляе ...