Характеристика компонентов, используемых в ИФА.

Страница 2

Образование конъюгата

Конъюгат – это антиген или антитело, меченные ферментной меткой. Обра­зование коньюгата – один из важных этапов проведения ИФА.

При формировании конъюгата подбирают такой оптимальный метод введе­ния ферментной метки, чтобы оба компонента конъюгата сохраняли свою био­логическую активность: фермент - способность взаимодействовать с субстра­том, а антиген или антитело - антигенность и антигенсвязывающую активность, соответственно. Наличие меченого, высокоочищенного антигена позво­ляет использовать конкурентные методы. В этом случае на конечном этапе можно измерять активность конъюгата, не связанного с иммобилизованными антителами, что позволяет избежать процедуры отмывки и делает анализ более удобным. Однако антигены разнообразны по своим физико-химическим свойст­вам и строению, а значит невозможно разработать универсальные методики для получения конъюгата с антигеном. В этом случае получение конъюгата антиге­на с ферментом представляет собой отдельную сложную задачу. Приготовление меченых антител для ИФА методически более доступно.

Конъюгирование фермента с иммунохимически активными белками про­изводится различными методами: химическая сшивка, ковалентное связывание молекулы фермента с АГ или AT и образование соединений через нековалентные связи, например, когда связь между ферментом и АГ или AT осуществляет­ся иммунологически, через взаимодействие антиген-антитело.

Наиболее широкое распространение получили ковалентные способы при­готовления конъюгатов. Выбор реакции связывания определяется типом дос­тупных функциональных групп в данных белковых молекулах. В качестве реа­гентов, используемых для введения фермента в молекулы антигенов и антител, используют глутаровый альдегид, периодат натрия и др.

Существует одноэтапный и двухэтапный методы получения конъюгатов с помощью глутарового альдегида. Могут образовываться конъюгаты различных размеров с редуцированной ферментативной активностью (15 - 60 % от свобод­ного фермента). Образовавшийся конъюгат больших размеров может стерически затруднять определение тестируемого вещества. Конъюгаты с относительно низкой молекулярной массой состоят из Fab-фрагмента и одной молекулы фер­мента.

В результате двухэтапного синтеза, который заключается в поэтапном получении сначала модифицированного с помощью сшивающего агента фер­мента, его выделении, а затем последующем взаимодействии его с антигеном (антителом), образуются молекулы однородного состава, содержащие 1-2 мо­лекулы фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую фер­ментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких обра­зовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5 - 10 %).

Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает 70-90 % от начального количества фермента).

Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами:

- высоким антительным тигром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, умень­шить неспецифическое связывание;

- достаточной специфичностью в рабочем разведении;

- преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные фор­мы имеют тенденцию к неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции;

- оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1);

- достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство опреде­ляется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате.

Твердая фаза

В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различ­ные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие вещест­ва. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планше­ты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.

Иммобилизация антигена или антител на твердой фазе возможна тремя путями:

– пассивная адсорбция, основанная на сильных гидрофобных взаимодействиях между белками и синтетической поверхностью;

– ковалентное прикрепление к твердой фазе;

– иммунохимическое и др. (нековалентное и неадсорбционное присоединение).

Пассивная адсорбция белков широко используется при проведении ИФА на платах для титрования, на нитроцеллюлозных мембранах. Пассивная адсорб­ция идет по принципу насыщения и коррелирует с молекулярной массой адсор­бируемого вещества. Адсорбционная поверхность мембран различного типа (нитроцеллюлоза, нейлон и др.) в 100-1000 раз выше, чем у пластика.

Страницы: 1 2 3

Дополнительные материалы

Практическая гомеопатия II
(1962) Личный опыт работы в качестве врача-гомеопата подтвердил мое убеждение, что врач не может контролировать процесс исцеления до тех пор, пока не разовьет в себе способность к холистическому клиническому видению паци­ента и не осознает, что единственной его целью является лечение единого внутреннего ядра болезненного процесса. Только холистический подход к каждому случаю позволит врачу применить симилиум и излечить пациента, стимулируя его жизненные силы. Вот почему гомеопат не должен огр ...