Характеристика компонентов, используемых в ИФА.

Страница 3

Твердая фаза

В качестве твердой фазы для проведения ИФА можно применять различ­ные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие вещест­ва. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планше­ты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки.

Иммобилизация антигена или антител на твердой фазе возможна тремя путями:

– пассивная адсорбция, основанная на сильных гидрофобных взаимодействиях между белками и синтетической поверхностью;

– ковалентное прикрепление к твердой фазе;

– иммунохимическое и др. (нековалентное и неадсорбционное присоединение).

Пассивная адсорбция белков широко используется при проведении ИФА на платах для титрования, на нитроцеллюлозных мембранах. Пассивная адсорб­ция идет по принципу насыщения и коррелирует с молекулярной массой адсор­бируемого вещества. Адсорбционная поверхность мембран различного типа (нитроцеллюлоза, нейлон и др.) в 100-1000 раз выше, чем у пластика.

Полисахариды и сильногликозилированные белки часто имеют низкую аффинность для полистирола. Необходимы другие методы для их иммобилиза­ции, например, ковалентное присоединение с помощью глутарового альдегида. Ковалентное присоединение эффективно, если в качестве твердой фазы исполь­зуются гидрофильные бусы (агароза) и полистироловые бусы.

Иммунохимические методы основываются на использовании предвари­тельно адсорбированных «ловушечных» антител для иммобилизации антигена или антител. Антиген, иммобилизованный иммунохимически, в 10 раз активнее, чем пассивно адсорбированный антиген. Могут использоваться лектины или иммуноглобулин-связывающие белки бактерий, которые легко адсорбируются на пластике или других гидрофобных поверхностях , например конканавалин А (Кон А) или стаффилококковый белок А. Кон А способен иммобилизовать gp 120 - белок вируса ВИЧ.

Свободные сайты на поверхности твердой фазы, не связавшиеся с сорби­руемым агентом, могут фиксировать в ходе теста другие молекулы, в том числе и конъюгаты, что приводит к повышению фонового сигнала. Для предотвраще­ния неспецифического связывания после иммобилизации на твердую фазу ос­новного материала проводят обработку нейтральными для теста веществами. Наиболее популярные блокирующие агенты - бычий сывороточный альбумин (БСА), казеин и др. Выбор блокирующего агента и условия проведения этого этапа зависят от типа твердой фазы, чувствительности системы.

Страницы: 1 2 3 

Дополнительные материалы

Процесс ассимиляции
Процесс ассимиляции животными окружающей среды протекает в двух формах: - идеальной ассимиляции; - реальной ассимиляции. 1. Идеальная ассимиляция Идеальная ассимиляция основана на способности животных иметь ощущения. Процесс ощущения животными внешнего мира распадается на пять видов чувств: осязания, обоняния, зрения, слуха и вкуса. Низшие виды животных всё ощущают только через осязание. У высших видов развиты все остальные чувства. Механические определения предметов – тяжесть, упругост ...