Варианты постановки ИФА.
Основные этапы непрямого ИФА для определения антител:
1. Антиген адсорбируют на твердой фазе, затем отмывают от несвязавшихся компонентов.
2. Блокируют свободные месга связывания. Отмывают.
3. В лунки вносят исследуемый материал, инкубируют и затем проводят процедуру отмывки. Параллельно ставят пробы с положительным и отрицательным контролями.
4. Добавляют антиглобулиновый конъюгат в рабочем разведении, инкубируют, отмывают от несвязавшихся компонентов.
5. Вносят субстрат, инкубируют. По достижении оптимального уровня окрашивания в лунках с положительным контролем реакцию останавливают, добавляя стоп-раствор.
6. Измеряют количество продукта реакции на ИФА-ридере (рис.3).
При оптимальных условиях проведения анализа метод высокоспецифичен и чувствителен. Он позволяет выявлять нанограммовые количества антител в сыворотках исследуемых больных. Для получения удовлетворительных результатов необходима стандартизация реагентов и методических приемов. Этот вариант ИФА может также использоваться для тестирования моноклональных антител.
«Сэндвич» – вариант ИФА для выявления антигенов.
Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повторяющимися, пространственно разделенными эпитопами одинаковой специфичности.
При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с исследуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки вносят меченные ферментом антитела (конъюгат) к тому же антигену и далее проводят все остальные этапы реакции. Эффективность образования специфического комплекса на каждой стадии анализа зависит от константы связывания реакции антиген-антитело.
Основные этапы анализа:
1. На твердой фазе иммобилизуют моноклональные антитела или аффинно-очищенные поликлональные антитела.
2. В лунки панелей вносят исследуемый образец, параллельно ставят положительный контрольный образец и отрицательный контрольный образец в различных разведениях. Инкубируют и отмывают.
3. В лунки вносят меченные ферментом моноклональные или поликлональные антитела – конъюгат. После инкубации проводят отмывку.
4. Вносят субстрат, инкубируют. Реакцию останавливают при достижении оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем.
5. Учет результатов на ИФА-ридере.
Основным достоинством метода является высокая чувствительность, превосходящая возможности других схем ИФА (рис.4).
Рисунок 3. Непрямой ИФА для выявления антител.
Конкурентный ИФА.
Этот вариант анализа основан на конкуренции меченых (конъюгат) и немеченых (исследуемых) антител за связывание с антигеном, адсорбированным на твердой фазе. Количество фермента, присоединившегося к твердой фазе, уменьшится пропорционально содержанию в смеси свободных антител. Для определения антигена используется тот же вариант, но в этом случае искомый антиген конкурирует с меченым, стандартным антигеном за связывание с антителами, иммобилизованными на поверхности твердой фазы.
Конкурентный метод требует минимального числа операций, незначительного расхода реагентов и легко может бытъ автоматизирован. При проведении конкурентного ИФА для выявления антител лучше использовать меченые моноклинальные антитела, тогда конкуренция конъюгата с исследуемым образцом происходит за единственный эпитоп адсорбированного на твердой фазе антигена. Этот вариант ИФА применяется для определения различных соединений, таких как иммуноглобулины человека, раково-эмбриональный антиген, инсулин и др. Он позволяет выявлять антитела к диагностически значимым эпитопам инфекционных агентов.
Основные этапы анализа для выявления антигена (рис.5):
1. На твердой фазе иммобилизуют специфические для выявляемого антигена моноклональные антитела.
2. В лунки панелей вносят в известной концентрации антиген, меченный ферментом, и исследуемый образец. Проводят инкубацию и отмывку. Параллельно в соседних лунках ставят положительный и отрицательный контроли. Для построения калибровки используют стандартный немеченый антиген в различных разведениях.
3. Добавляют субстрат, инкубируют, останавливают реакцию при развитии оптимального окрашивания в лунках с положительным контролем.
4. Учет реакции на ИФА-ридере.
В этом случае количество антигена в исследуемом образце обратно пропорционально ферментативной активности на твердой фазе.
Ингибиторный ИФА.
Дополнительные материалы
Об авторе и его книге
Томас Пабло Паскеро - гомеопат с мировым именем, был почетным основателем Медицинской гомеопатической школы Аргентины. Классический гомеопат школы Кента, он учился в Чикаго у непосредственного преемника Кента доктора Артура Триммера и обладал таким глубоким знанием и пониманием классического метода, которого редко кому удается достичь. Помимо прочего, он привнес в свою работу глубокое знание психологии, которое, в сочетании с классическими принципами, помогали ему лучше понять, а следовател ...