Варианты постановки ИФА.
В этом варианте ИФА антиген, присутствующий в исследуемом образце, связывается с моноклональными антителами, меченными ферментной меткой, и ингибирует их взаимодействие со стандартным антигеном, иммобилизованным на твердой фазе. Присутствие в образце даже следовых количеств специфичного к конъюгату антигена будет ингибировать связывание меченых антител с иммобилизованным антигеном. Степень ингибирования прямо пропорциональна содержанию антигена в растворе. Для проведения количественного анализа строят кали6ровочную кривую с помощью последовательных разведений стандартного антигена. Основные этапы ингибиторного ИФА для выявления антигена (рис.6).
1. В лунках панелей адсорбируют стандартный антиген. Подбирают рабочее разведение меченых антител с помощью титрования.
Рисунок 4. «Сэндвич»- вариант ИФА.
Рисунок 5. Конкурентный ИФА Рисунок 6. Ингибиторный ИФА
2. Проводят предварительную инкубацию конъюгата в разведении, предшествующем рабочему, с разведениями исследуемого образца, стандартного антигена и положительных контрольных проб.
3. Смесь переносят в лунки панелей. Для контроля 100%-ного связывания в несколько лунок вносят только меченые антитела, без ингибирующего антигена. Панели инкубируют, затем проводят отмывку.
4. Добавляют субстрат.
5. Проводят учет результатов.
Концентрация определяемого антигена в исследуемом образце обратно пропорциональна ферментативной активности на твердой фазе.
ИФА может использоваться не только для определения растворимого антигена или антитела, но и клеток, вырабатывающих различные белки.
Метод иммуноферментных пятен (ELISPOT).
В 1983 году адаптировали технологию твердофазного ИФА для определения лимфоидных клеток, секретирующих антитела или антигены (например, цитокины), in vitro. Метод получил название ELISPOT (метод иммуноферментных зон или пятен). Основной принцип метода:
1. На поверхности полистироловой лунки (используют 24-х луночные панели для культивирования клеток) сорбируют антигены или антитела, которые служат «ловушечными» реагентами.
2. Добавляют исследуемые лимфоидные клетки, культивируют несколько часов при 37°С, давая им возможность занять определенное место и выполнить секреторную функцию. Антитела или антигены, секретируемые такими клетками, улавливаются адсорбированными на твердой фазе реагентами.
3. Клетки удаляют, используя для этого отмывающий раствор с детергентом, лизирующим клетки.
4. Участки накопления секреторных продуктов проявляют, добавляя связанные с ферментом антитела (антиглобулиновый реагент).
5. Добавляют смесь субстрата с агарозой (используемые субстраты должны растворяться в агарозе и образовывать нерастворимые продукты реакции), на поверхности твердой фазы образуются коричневые или голубые пятна (в зависимости от используемых ферментов и субстратов), выявляя участки, где располагались клетки.
• Образовавшиеся пятна подсчитывают под микроскопом, это и будет количество секретирующих клеток.
В качестве твердой фазы может быть использована нитроцеллюлозная мембрана В этом случае есть ряд преимуществ: из-за высокой адсорбционной способности НЦМ требуется значительно меньшее количество антигена, используемого в качестве «ловушечного» реагента, кроме того, отпадает необходимость во включении агарозы в субстрат.
При параллельном определении количества секретирующих клеток и общего количества секретируемого антигена или антитела в лунке, что возможно при использовании другого субстрата, можно выявить количество секретируемого вещества единичной клеткой.
Данный метод нашел широкое применение для оценки количества клеток, секретирующих антиген, улавливаемый адсорбированными антителами, используется для определения количества клеток, секретирующих цитокины (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИФН-у, ФНО-а).
Дополнительные материалы
Основные этапы становления этики
История этической мысли удивительно разнообразна и противоречива. Ее противоположные тенденции, своеобразно отражающие борьбу основных философских учений, были представлены в истории этики многообразием школ и направлений.
Античная этика является по преимуществу учением о добродетелях и добродетельной личности. Демокрит первым из античных мыслителей обращается к внутреннему миру человека. При определении нравственной ценности поступка он считает необходимым учитывать единство желания и действ ...